以乳杆菌物种为主的菌群与各种不良健康后果的风险降低有关。然而，许多健康女性的微生物群并不以乳杆菌为主。为了确定推动菌群组成的因素，对健康女性菌群的基因组成和转录活性进行了表征。结果表明，一个物种的丰度并不总是其转录活性的指示物，并且可以从转录组学数据预测群落组成的未来变化。功能比较突出了这些群落代谢活动的差异，尤其是在降解宿主产生的粘蛋白（而非糖原）方面。非乳杆菌主导的菌群对粘蛋白的降解可能与不良健康结果有关。最后，本研究发现L. crispatus、L. iners和Gardnerella vaginalis的转录活性随其所在群落的分类组成而变化。值得注意的是，L. iners和G. vaginalis与乳杆菌共存时均表现出较低的胆固醇依赖性溶细胞素表达，而当与其他兼性和专性厌氧菌共存时表现出较高的表达。这些物种的致病潜力可能取决于它们所存在的菌群，因此可以通过干预策略进行调节。本研究为菌群的功能生态提供了见解，展示了宏转录组数据的诊断潜力，并揭示了这些生态系统的调节策略。

　　研究人员对39名北美育龄妇女(年龄范围：19-45岁)在5个时间点(间隔2周)的微生物群进行了表征。研究中的受试者是黑人或非裔美国人(n =24)、白人或高加索人(n = 10)、西班牙裔或拉丁裔(n = 4)和亚裔(n = 1)。对这些样本进行宏基因组(n = 194)和宏转录组(n = 180)测序，并将测序结果映射到VIRGO，这是一个非冗余的、全面的微生物组基因目录，以确定宏基因组和宏转录组的分类组成(图1)。宏基因组组成代表菌群的相对丰度，而宏转录组组成代表菌群的相对活性(附表1)。 研究人员首先确定一个物种的相对丰度是否与其相对转录活性一致。一个物种的相对活性除以其相对丰度的比率被称为其“相对表达”，代表了与宏基因组相比，该物种在宏转录组中的表达是过度或不足。研究人员计算了25种高丰度的菌种在研究范围内的相对表达值，其中包括四种常见的乳杆菌物种，G. vaginalis、Atopobium vaginae、hnocurva vaginae和Prevotella spp.，以及其他几种兼性或专性厌氧菌(图2A)。对于每个物种和样本，观察到的相对表达值范围很广，从过度表达到表达不足。G. vaginalis、A. vaginae、Finegoldia magna、Mobiluncus mulieris和咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)更可能表达不足(中位相对表达 0，图2A)，而其他20种更可能表达过度(中位相对表达 0)，尤其是Sneathia amnii(中位相对表达= 3.3，图2A)和S. sanguinegens(中位相对表达= 2.2，图2A)。

　　研究人员分析一个物种的相对表达是否与其相对丰度相关。因为这两个数据集都是组成的，所以对相对表达的评估以最高和最低相对丰度为界。如果估计一个物种的相对丰度为90%，其相对表达的最大值约为1.1。相反，如果一个物种只占菌群群落的一小部分，其相对表达的最小值受转录组测序深度的限制。研究人员发现一个物种的丰度与其相对表达之间存在密切关系(图2B-G；线)。在极少的情况下，细菌的转录活性比它们的相对丰度所显示的要高。而相对丰度较高的物种往往对宏转录组贡献不足。从过度表达到表达不足因物种而异(图2B-G；补充文件2：附图1；线)。例如，L. crispatus、L. iners和G. vaginalis(图2B - D)等物种往往在较高的相对丰度下被发现，一般为过度表达。相反，A. vaginae和Ca. L. vaginae菌种(图2E，F)在中等或较低的相对丰度下发现，较低的相对丰度下活性表达不足(x-截距 10−2相对丰度)。S. amnii(图2G)和S. sanguinegens(补充文件2：附图1)相对丰度较低，但发现它们有较高的转录活性。

　　每个物种对相应样本相对表达活性的贡献(n=180，图B)。这两个估计值都是使用VIRGO得出的，并对基因长度进行了校正。样本在两个数据集中按相同的顺序排序。缺口表示没有相应的宏转录组数据可用的14个样本。基于VALENCIA的分类组成，将群落划分为CST：CST I–L. crispatus为主，CST II–L. gasseri为主，CST III–L. iners为主和CST V–L. jensenii为主和CST IV。

　　菌群中25个最丰富物种的相对基因表达是通过将物种相对表达活性除以其在宏基因组中的相对丰度(A)来计算的。物种在群落中的相对表达与其相对丰度之间的关系(B-G)。

　　一个物种或菌株的相对转录活性可能对其未来在微生物群落中的丰度有一定的影响。人们可能会认为，相对表达量低的物种可能会经历相对丰度的下降，而相对表达量高的物种可能会增加。此研究的纵向数据集能够验证这一假设。研究人员评估了间隔两周的两个连续时间点之间log10转化物种相对丰度的变化。正如假设的那样，此研究发现一个物种的相对丰度变化与其早期表达水平之间存在密切关系(图3A；线)。相对表达低的物种相对丰度降低，而相对表达高的物种相对丰度增加。研究人员还发现在这种关系中支持物种特异性截获(图3B；线周时间间隔内维持其相对丰度所需的相对表达。大多数菌群需要增加表达，以维持其相对丰度。值得注意的是，S. anginosus和F. magna被发现能够在表达不足的情况下保持其相对丰度，而S. amnii和S. sanguinegens需要高度表达才能保持其相对丰度。

　　一个物种从一个时间点(T1)到下一个时间点(T2)的相对丰度的Log10倍变化，作为其在T1时相对表达量的函数(A)。该模型中的物种特异性截获代表物种在T1至T2之间维持其相对丰度所需的最小相对表达(B)。

　　根据定义，CSTs在组成方面有很大差异，因此，预期它们在功能方面也会有很大差异。为了表征这些差异，研究人员在代表分子功能的KEGG orthologs(KOs)水平上进行了差异表达分析。将分析重点放在CST I、CST III和CST IV的比较上，因为该数据集中几乎没有CST II和CST V的例子。这些CSTs之间的比较揭示了大量差异表达的KO(图4A-C)。其中包括预期的差异，如CST I中D-乳酸脱氢酶(K03778)的表达量比CST III和IV高4.6倍和4.8倍，其催化丙酮酸产生D-乳酸。在CST I和IV之间，KO差异表达的数量和幅度最大(图4B)。在宏基因组数据中，大多数被鉴定的差异表达KEGG功能差异丰富，表明这些群落的功能能力存在潜在差异。然而，也有一些KO同样丰富，但表达不同(图4A-C中用钻石表示)。

　　例如，ptsAB磷酸转运系统(K02036和K02038)在CST I、III和IV中的丰度相等，在CST I中的表达比在CST III和IV高约4倍。另一个例子是α-L-鼠李糖苷酶(K05989)，其在CST I和IV中的丰度相等，但在CST IV中的表达高3倍。 接下来，我们表征了对每个差异表达的KO有贡献的分类群，以确定CSTs活性能变异的驱动因素(图4D-F)。对于每个KO，计算了每个分类单元对其在每个CST中表达的平均贡献。正如预期的那样，研究人员发现，与CST III或CST IV相比，CST I中富集的KEGG功能主要来源于L. crispatus(图4D，E)。因为，L. crispatus是CST I的优势物种。与CST I相比，CST III中丰富的功能来源并不主要是CST III的优势菌群(L. iners)。

　　相反，这些功能的表达主要来源于G. vaginalis、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和几种Prevotella spp.(2-4倍差异，图4D)。只有KO在这个比较中显示出较高的倍数变化，主要归因于L. iner。与CST I或CST III相比，发现在CST IV中富集的KO的表达可归因于多个物种。G. vaginalis和A. vaginae是CST IV群落的两个特征类群，但它们并不负责这些差异表达的KO中的大多数；而Ca. L. vaginae、Sneathiaspp.和Prevotellaspp.则表达这些功能。 差异表达的KO也被分组到KEGG模块。这种更高层次的功能分类描述了KOs，它们协同作用以执行功能。基于KEGG模块与CST I、III和IV的关联模式，使用层次聚类对其进行分组。这将KEGG模块区分为7组(图5)。

　　其中一组包括在CST I中表达高于CST III或IV的KEGG模块。这一组包括β-葡萄糖苷、甘露醇、膦酸酯、磷酸盐和腐胺转运系统，以及半胱氨酸、赖氨酸、胡萝卜素和辅酶F420的生物合成。另一组KEGG模块与CSTs I和III中的高表达相关，包括锌/锰、谷氨酰胺、葡萄糖醇转运体，以及熊果苷样PTS系统。没有一组KEGG模块在CST III中表现出单独高表达，这可能反映了L. iners因其基因组大小减小而导致的功能有限。相反，有两组模块在CST III和IV中表现出较高的表达，这些模块与CST III的关联主要由除L. iners以外的物种驱动。这两组包括谷氨酸转运、蛋氨酸降解、铁和锌转运以及组氨酸生物合成。最后，一些模块仅与CST IV相关。该组包括负责支链氨基酸转运、麦芽糖/葡萄糖运输、细胞溶血素运输、趋化性、半乳糖胺运输、LPS运输和硫降解的KEGG模块。

　　火山图显示了不同群落状态类型(A、C和E)之间KEGG orthologs表达的log2倍变化差异。蓝色点代表差异表达和差异丰度的KEGG orthologs。点表示差异表达但丰度无差异的KEGG orthologs。在B、D和F中，显示了负责这些KO表达的分类群。对于每个倍数变化类别，将显示每个分类单元的相对贡献。条形图上方的数字表示该类别中差异表达的KEGG orthologs的数量。*DE，差异表达。

　　图5 与CST相关的KEGG模块表达差异相关。差异表达的KEGG同源基因被映射到KEGG模块(代表代谢功能)。

　　热图显示了KEGG模块的平均对数2倍变化值，在三组比较(CST I与CST III；CST I与CST IV，或CST III与CST IV)中的一次比较中显示出至少四倍的差异。三组比较中的每一次都绘制了两列，每一列代表KEGG模块，其直系图在指定的CST中表现出更高的表达。一些KEGG模块包括KEGG同源基因，它们在每个比较的CST中都有较高的表达。使用Euclidean距离和Ward链接对倍数变化值进行分层聚类，将模块分为七类。

　　宿主产生的糖原和粘蛋白都被认为是细菌碳和能量的重要来源。最近的研究已经确定了微生物群代谢这些产物的相关基因，包括Lactobacillus spp.的糖原脱支酶和G. vaginalis的唾液酸酶。本研究检测了这些酶和其他参与糖原和粘蛋白降解的酶，以确定它们在分配给不同CSTs的菌群中的表达是否不同。

　　使用碳水化合物活性酶(CAZy)注释确定了负责这些功能的VIRGO基因。糖基水解酶(GH)家族13和糖基转移酶(GT)家族35中的酶可能分别具有糖原脱支和糖原磷酸化酶活性。脱支酶作用于α-糖苷键，可以从糖原中释放海藻糖、葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖。这些酶在CST中的表达相似，约为每百万1250个转录本(TPM)，尽管在CST III菌群中的表达略高(线A)。糖原脱支酶的表达归因于常见的许多细菌，包括Lactobacillus spp.、G. vaginalis、Ca. L. vaginae、Prevotella spp.和Sneathia spp.，并且与CSTs的物种组成一致。

　　例。